Akademik Veri Yönetim Sistemi
YÜZÜGÜLLÜ KARAKUŞ Y. (Yürütücü), DUMAN Y., Person A. R.(Yürütücü)
TÜBİTAK Projesi, 3501 - Ulusal Genç Araştırmacı Kariyer Geliştirme Programı, 2014 - 2014
Proje Özeti
Termofilik mantarlar 45 ila 65ºC arasında üreyebilen ve sıcaklığa en fazla dayanabilen ökaryotik canlılardır. Bu tip mantarların ürettikleri enzimler, ısıya, denaturasyona ve proteolize karşı direnç göstermeleri açısından endüstriyel öneme sahiptirler. Bunlardan biri olan katalaz enzimi antioksidan metalloenzimler grubuna dahil olup başlıca işlevi H2O2’in su ve moleküler oksijene parçalanmasıdır. Asıl fonksiyonunun yanında, ortamda uygun bir organik elektron verici bulunduğunda peroksidatif aktivite de gösterebildiği gözlenmiştir. Bu ikincil aktivite, genel olarak, peroksit yıkımı beraberinde gerçekleşen metanol, etanol, formik asit ya da fenol gibi organik bileşiklerin oksidasyonu şeklinde tanımlanmaktadır. Genelde hidrojen peroksit (H2O2) seviyesinin oldukça düşük olduğu durumda bu peroksidatif aktivite önem kazanmaktadır. Yakın bir geçmişte çalışma grubumuz tarafından yayınlanan ilk bulgulara göre, S. thermophilum tarafından büyümeye paralel olarak üretilen katalaz enzimi hidrojen peroksit ya da herhangi bir kofaktöre ihtiyaç duymayan bir oksidaz aktivitesine sahiptir (Sutay Kocabas, 2008; Yuzugullu, 2013). Literatürde memeli katalaz-oksidazı adı altında bu tür bir katalaz enzimine dair tek bir yayın bulunabilmiştir (Vetrano, 2005). Bu yayında, bu tür bir bulgunun bir ‘ilk’ olduğu vurgulanmakta ancak fenol oksidaz aktivite mekanizmasının bilinmediği belirtilmektedir. Buradan, çift aktiviteli katalaz/fenol oksidaz türü enzimlerin çok daha yaygın olabileceği, hatta insanda da olabileceği anlaşılmaktadır. Ancak enzimin oksidatif mekanizması henüz tam olarak aydınlatılmamıştır.
S. thermophilum katalaz (CATPO) enzimi y. 320 kDa molekül ağırlığında tetramerik bir enzimdir. Amino asit dizilimi ve tahmini 3-boyutlu yapısı itibarı ile ‘monofonksiyonel büyük katalazlar’ ailesinin bir bireyi olduğu anlaşılmaktadır (Sutay Kocabas, 2008). Scytalidium katalaz geni daha önceden Novo Nordisk tarafından klonlanmış (US Patent no: 5571719), ancak bu patent içinde enzimin bir fenol oksidaz aktivitesine sahip olduğuna dair bir bilgi bulunamamıştır. Saf enzim kullanılarak yapılan biyodönüşüm denemelerinde ise, CATPO’nun katekol, p-hidrokinon, katekin, kuersetin, klorojenik asit ve kafeik asit gibi çok farklı yapılara sahip fenolik maddeleri okside edebildiği gözlenmiştir (Tübitak Proje No: 107T611). Bu nedenle, fenol oksidaz reaksiyon mekanizmasının katalitik döngüde nasıl yer aldığı merak konusudur. Çift aktivite gösteren bu enzimin yapısını araştırmak amacıyla İngiltere Leeds Üniversitesi ile işbirliği halinde rekombinant ekspresyon sistemlerinin geliştirilmesi, bölge yönelimli mutagenez, kristalizasyon ve üç-boyutlu yapı çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Yapılan denemeler neticesinde enzim için en iyi kristalizasyon koşulu tespit edilmiş ve X-ışını verileri Diamond Işınım Kaynağı (İngiltere) tesisinde 1.4 Å çözünürlükte elde edilmiştir (Yuzugullu, 2013). Katalazların biyokimyasal ve yapısal karakterizasyonu ile ilgili literatürde çok sayıda rapor olmasına rağmen, özellikle oksidaz aktivitesiyle ilgili olarak enzim substratının ve reaksiyon ürünlerinin aktif bölgede nasıl hareket ettiklerine dair temel sorular henüz açıklanmamıştır.
Önerilen projenin amacı, S. thermophilum katalazının (CATPO) katalitik mekanizmasının daha detaylı incelenmesi üzerine aktif bölge içinde oksidatif aktivitede rolü olabilecek amino asit kalıntılarını hedef alarak mutasyon çalışmalarının gerçekleştirilmesi, elde edilecek değişik katalaz varyantlarının biyokimyasal karakterlerinin karşılaştırılması ve de CATPO’nun çeşitli katalaz ve oksidaz inhibitörleri ile meydana getireceği kompleksin fonksiyonel analizinin gerçekleştirilmesidir. Enzimoloji açısından henüz çok yaygın bir olgu olmayan çift aktivitenin daha ayrıntılı olarak araştırılmasının, özelinde katalazlar ve oksidazlar, genelinde ise enzim mühendisliği alanında özgün uygulamaların geliştirilmesi anlamında da yararlı bilgiler sunacağına ve oksidatif aktivitenin katalitik mekanizmadaki rolünün anlaşılmasına ışık tutacağına inanılmaktadır.
36 ay süre olarak önerilen çalışmalar 2 ana başlıkta toplanmıştır:
1. Katalaz ve oksidaz aktivitelerini birbirinden ayırmak için çeşitli mutasyonların gerçekleştirilmesi ve elde edilecek farklı varyantların kinetiğinin araştırılması.
2. Enzimin çeşitli katalaz ve oksidaz inhibitörleri (örneğin; 3-amino-1,2,4-triazol (3TR), perasetik asit, bakır sülfat) ile meydana getireceği kompleksin biyokimyasal karakterizasyonu.