Akademik Veri Yönetim Sistemi
Kasap M. (Yürütücü)
TÜBİTAK Projesi, 2020 - 2022
Bir kısmı hücre zarına
gömülü bir kısmı ise hücre dışına bakan proteinler Hücre Yüzey Proteinleri
(HYP) olarak adlandırılırlar. Bu proteinler arasında G-proteinleri gibi hücre
yüzey reseptörleri, Na+/K+ ATPase gibi protein kanalları/pompaları, ATP sentaz
gibi enzimatik aktivite gösteren proteinler ve kaderinler gibi hücre adezyon
proteinleri bulunmaktadır. HYP’ler aracılığı ile hücreler arası iletişim
sağlanabilmekte, hücreler dış ortamdaki değişiklikleri algılayabilmekte ve bu
değişikliklere adapte olup cevap verebilmektedirler. Hücrelerin bir hücre popülasyonu içerisinde sağlıklı
bir şekilde yaşayabilmeleri ve çevresel etkileşimleri için HYP’lerin
işlevselliklerini korumaları gerekmektedir. Bu nedenle HYP’lerin izolasyonu,
tanımlanması ve karakterizasyonu hücre popülasyonlarının davranışlarının
anlaşılması açısından oldukça önemlidir. Ayrıca, HYP’ler sadece temel
araştırmalar açısından değil klinik çalışmalar açısından da değer ifade eden
moleküllerdir. Çünkü bu proteinlerin birçoğu doğrudan ilaçların ana hedefi olmakla
birlikte birçok patojenin hücreleri enfektte etmek amaçlı kullandıkları yoldur.
Özellikle, ilaç veri bankasındaki ilaçların birçoğunun (%66) HYP’leri hedef
aldığı gösterilmiştir (Drugbank, erişim tarihi: 25 Haziran 2020). Buna rağmen deneysel
olarak varlıkları gösterilmiş HYP sayısı tahmin edilen HYP sayının çok altındadır.
Bugüne kadar tanımlanan HYP sayısının az olmasının en temel nedeni bu
proteinlerin hidrofobik karakterde olmaları ve izolasyonlarının zor olmasıdır. Bu proteinlerin izolasyonu ve tanımlanması
için çabalar sürmektedir (Yoneten K.K., ve diğ. 2019; Akdag M. ve diğ. 2020).
Şu ana kadar geliştirilen protokoller HYP’lerin izolasyonu için
biyokimyasal yaklaşımların kullanımını öngörmektedir. Bu yaklaşımlar arasında
bizimde laboratuvarımızda deneyimlediğimiz kimyasal biyotinilasyon ile
izolasyon, seçici CyDye işaretlemesi ile tanımlama, sıcaklık-bağımlı faz
partisyonu ile zenginleştirme ve densite-gradyan santrifügasyonu ile
zenginleştirme ön plana çıkan yaklaşımlardır. Kimyasal biyotinilasyon yaklaşımı
sıklıkla tercih edilen bir yaklaşım olup hücre yüzey proteinlerinin kimyasal
ajanlarla biyotinile edilip avidin kolon üzerinden zenginleştirilmesi esasına
dayanmaktadır. 2016 yılında tamamladığımız 113S868 nolu TUBİTAK projemizde
kimyasal biyotinilasyon metodu kullanarak CHO hücrelerinden HYP’leri
zenginleştirmeye çalıştık. Deneyimlerimiz bu metodun verimli bir metot
olmadığını ve çoğu zaman HYP’leri zenginleştirmede yetersiz kaldığını gösterdi
(Yöneten K.K. ve diğ. 2019). Yaptığımız literatür araştırmasında bizim deneyimlerimizi
başka laboratuvarların da yaşadığını ve bu nedenle bilim camiasında alternatif
arayışların olduğunu gördük (Akdag
M. ve diğ. 2020). Bu bağlamda proteinlere biyotin
ekleyebilen Protein Biyotin Ligaz enzimlerinin (PBL) kimyasal ajanların yerini alabileceği
öngörülmektedir. Özellikle Escherichia coli bakterisine ait ve yönlendirilmiş
evrimleştirme tekniği kullanılarak geliştirilmiş olan TurbolD proteini (E.
coli BirA proteininin mutantı) bu potansiyele sahiptir (Lee S.Y. ve diğ. 2016).
Literatürde yapılan çalışmalarda hücre içerisinde üretilerek plazma membranına
yönlendirilen TurboD’nin HYP’leri etkili bir şekilde biyotinile ettiği gösterilmiştir.
Ancak, yapılan deneylerin zaman alması (TurbolD geninin hücrelere transfeksiyonu,
ekspresyonu ve HYP izolasyonu), TurbolD’nin aşırı aktif olması nedeni ile
sitoplazmik proteinleri de biyotinleyerek HYP izolatlarının kirliliğine sebep
olması, spesifik olmayan biyotinasyonların hücre metobolizmasını etkilemesi,
maddi olarak kullanılan deneysel sistemin masraflı olmasından dolayı TurbolD’nin hücre içi ekspresyonundan
ziyade saflaştırıldıktan sonra doğrudan kültür ortamına eklenebileceğinin daha avantajlı
olabileceği ihtimalini aklımıza getirdi. Bu amaçla yaptığımız ön
çalışmalarda yabanıl tip BirA biyotin protein ligaz enzimini çözünür formda
aktif halde kolaylıkla saflaştırılırken, TurbolD’nin üretim sırasında hücre
içinde çöktüğünü ve aktif halde saflaştırılmasının mümkün olmadığını gördük.
Yaptığımız her denemede TurbolD çöküyor ve ancak inaktif formda
saflaştırılabiliyordu (üre varlığında). Bu soruna çözüm üretebilmek için
TurbolD’yi E. coli maltoz-bağlama
proteini (MBP) ile füzyona uğrattık ve füzyon proteinini çözünür formda
çökmeden saflaştırabildik. Daha da önemlisi füzyon proteininin yüksek biyotin
protein ligaz aktivitesi gösterdiğini tespit ettik. Ancak, deneylerimizi bütçe
sıkıntısı yaşadığımızdan dolayı bir sonraki aşama olan saflaştırılmış TurbolD
proteini ile yüzey proteinlerinin işaretlenmesi, zenginleştirilmesi ve LC-MS/MS
ile karakterizasyonu noktasına getiremedik. Bu projedeki amacımız
saflaştırdığımız MBP-TurbolD füzyon proteinini ve bu proteinin protein
mühendisliği yoluyla modifiye edilmiş formları kullanarak HYP’leri
biyotinleştirmek, biyotinleştirdiğimiz HYP’leri avidin kolon kullanarak
zenginleştirmek ve tanımlamaktır. Bu amaçla projemizde CHO hücrelerini
kullanacağız. Böylelikle proje kapsamında elde ettiğimiz verilerimizi bir
önceki TUBİTAK projemizde ürettiğimiz çıktılar ile karşılaştırma imkânı
bulabileceğiz. Geliştireceğimiz yaklaşımla hücrelerin iç dinamiğini değiştirmeden,
etkin, hızlı ve ekonomik bir şekilde HYP’lerin zenginleştirilmesine
ve tanımlanmasına izin veren yöntemler ortaya koyacağız. Ayrıca bu
yöntemlerin kitleştirilebilme potansiyelleri de araştırılacaktır.