Akademik Veri Yönetim Sistemi
Kasap M. (Yürütücü), Akpınar G., Karadenizli A.
TÜBİTAK Projesi, 2021 - 2023
Bir kısmı hücre zarına gömülü bir kısmı ise hücre dışına bakan proteinler Hücre Yüzey Proteinleri (HYP) olarak adlandırılırlar. Bu proteinler arasında G-proteinleri gibi hücre yüzey reseptörleri, Na+/K+ ATPase gibi protein kanalları/pompaları, ATP sentaz gibi enzimatik aktivite gösteren proteinler ve kaderinler gibi hücre adezyon proteinleri bulunmaktadır. HYP’ler aracılığı ile hücreler arası iletişim sağlanabilmekte, hücreler dış ortamdaki değişiklikleri algılayabilmekte ve bu değişikliklere adapte olup cevap verebilmektedirler. Hücrelerin bir hücre popülasyonu içerisinde sağlıklı bir şekilde yaşayabilmeleri ve çevresel etkileşimleri için HYP’lerin işlevselliklerini korumaları gerekmektedir. Bu nedenle HYP’lerin izolasyonu, tanımlanması ve karakterizasyonu hücre popülasyonlarının davranışlarının anlaşılması açısından oldukça önemlidir. Ayrıca, HYP’ler sadece temel araştırmalar açısından değil klinik çalışmalar açısından da değer ifade eden moleküllerdir. Çünkü bu proteinlerin birçoğu doğrudan ilaçların ana hedefi olmakla birlikte birçok patojenin hücreleri enfektte etmek amaçlı kullandıkları yoldur. Özellikle, ilaç veri bankasındaki ilaçların birçoğunun (%66) HYP’leri hedef aldığı gösterilmiştir (Drugbank, erişim tarihi: 25 Haziran 2020). Buna rağmen deneysel olarak varlıkları gösterilmiş HYP sayısı tahmin edilen HYP sayının çok altındadır. Bugüne kadar tanımlanan HYP sayısının az olmasının en temel nedeni bu proteinlerin hidrofobik karakterde olmaları ve izolasyonlarının zor olmasıdır. Bu proteinlerin izolasyonu ve tanımlanması için çabalar sürmektedir. Şu ana kadar geliştirilen protokoller HYP’lerin izolasyonu için biyokimyasal yaklaşımların kullanımını öngörmektedir. Bu yaklaşımlar arasında bizimde laboratuvarımızda deneyimlediğimiz kimyasal biyotinilasyon ile izolasyon, seçici CyDye işaretlemesi ile tanımlama, sıcaklık-bağımlı faz partisyonu ile zenginleştirme ve densite-gradyan santrifügasyonu ile zenginleştirme ön plana çıkan yaklaşımlardır. Kimyasal biyotinilasyon yaklaşımı sıklıkla tercih edilen bir yaklaşım olup hücre yüzey proteinlerinin kimyasal ajanlarla biyotinile edilip avidin kolon üzerinden zenginleştirilmesi esasına dayanmaktadır. 2016 yılında tamamladığımız 113S868 nolu TUBİTAK projemizde kimyasal biyotinilasyon metodu kullanarak CHO hücrelerinden HYP’leri zenginleştirmeye çalıştık. Deneyimlerimiz bu metodun verimli bir metot olmadığını ve çoğu zaman HYP’leri zenginleştirmede yetersiz kaldığını gösterdii. Yaptığımız literatür araştırmasında bizim deneyimlerimizi başka laboratuvarların da yaşadığını ve bu nedenle bilim camiasında alternatif arayışların olduğunu gördük. Bu bağlamda proteinlere biyotin ekleyebilen Protein Biyotin Ligaz enzimlerinin (PBL) kimyasal ajanların yerini alabileceği öngörülmektedir. Özellikle Escherichia coli bakterisine ait ve yönlendirilmiş evrimleştirme tekniği kullanılarak geliştirilmiş olan TurbolD proteini (E. coli BirA proteininin mutantı) bu potansiyele sahiptir.r Literatürde yapılan çalışmalarda hücre içerisinde üretilerek plazma membranına yönlendirilen TurboD’nin HYP’leri etkili bir şekilde biyotinile ettiği gösterilmiştir. Ancak, yapılan deneylerin zaman alması (TurbolD geninin hücrelere transfeksiyonu, ekspresyonu ve HYP izolasyonu), TurbolD’nin aşırı aktif olması nedeni ile sitoplazmik proteinleri de biyotinleyerek HYP izolatlarının kirliliğine sebep olması, spesifik olmayan biyotinasyonların hücre metobolizmasını etkilemesi, maddi olarak kullanılan deneysel sistemin masraflı olmasından dolayı TurbolD’nin hücre içi ekspresyonundan ziyade saflaştırıldıktan sonra doğrudan kültür ortamına eklenebileceğinin daha avantajlı olabileceği ihtimalini aklımıza getirdi. Bu amaçla yaptığımız ön çalışmalarda yabanıl tip BirA biyotin protein ligaz enzimini çözünür formda aktif halde kolaylıkla saflaştırılırken, TurbolD’nin üretim sırasında hücre içinde çöktüğünü ve aktif halde saflaştırılmasının mümkün olmadığını gördük. Yaptığımız her denemede TurbolD çöküyor ve ancak inaktif formda saflaştırılabiliyordu (üre varlığında). Bu soruna çözüm üretebilmek için TurbolD’yi E. coli maltoz-bağlama proteini (MBP) ile füzyona uğrattık ve füzyon proteinini çözünür formda çökmeden saflaştırabildik. Daha da önemlisi füzyon proteininin yüksek biyotin protein ligaz aktivitesi gösterdiğini tespit ettik. Ancak, deneylerimizi bütçe sıkıntısı yaşadığımızdan dolayı bir sonraki aşama olan saflaştırılmış TurbolD proteini ile yüzey proteinlerinin işaretlenmesi, zenginleştirilmesi ve LC-MS/MS ile karakterizasyonu noktasına getiremedik. Bu projedeki amacımız saflaştırdığımız MBP-TurbolD füzyon proteinini ve bu proteinin protein mühendisliği yoluyla modifiye edilmiş formları kullanarak HYP’leri biyotinleştirmek, biyotinleştirdiğimiz HYP’leri avidin kolon kullanarak zenginleştirmek ve tanımlamaktır. Bu amaçla projemizde CHO hücrelerini kullanacağız. Böylelikle proje kapsamında elde ettiğimiz verilerimizi bir önceki TUBİTAK projemizde ürettiğimiz çıktılar ile karşılaştırma imkânı bulabileceğiz. Geliştireceğimiz yaklaşımla hücrelerin iç dinamiğini değiştirmeden, etkin, hızlı ve ekonomik bir şekilde HYP’lerin zenginleştirilmesine ve tanımlanmasına izin veren yöntemler ortaya koyacağız. Ayrıca bu yöntemlerin kitleştirilebilme potansiyelleri de araştırılacaktır.