Akademik Veri Yönetim Sistemi
Tezin Türü: Doktora
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Kocaeli Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Temel Tıp Bilimleri, Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2023
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: MEHMET SARIHAN
Danışman: Murat Kasap
Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu
Özet:
Amaç: Günümüzde yaygın olarak görülen kanser türlerinden meme kanseri (MK), dünya genelinde yüksek insidansa ve ölüm oranına sahiptir. Yıllardır süren çalışmalara ve kaydedilen önemli bilimsel gelişmelere rağmen, MK'nin teşhisi ve tedavisi için henüz özgün bir biyobelirteç bulunamamıştır. Tez çalışması kapsamında sağlıklı (MCF-10A) ve kanserli meme hücre hatlarının (MCF-7 ve MDA-MB-231), karşılaştırmalı hücre yüzey proteom analizleri yapılarak meme kanseri teşhis ve tedavisinde kullanılma potansiyeli olabilecek biyobelirteç adayları saptandı. Tez kapsamında analizler gerçekleştirilirken hücre proteomunun deneysel şartlardan etkilenmemesi ve hücre yüzey proteomundaki gerçek değişimlerin saptanabilmesi için literatürde sıkça kullanılan ancak problemli bir yaklaşım olan kimyasal biyotinilasyon yerine tez kapsamında geliştirdiğimiz yeni bir yaklaşım olan enzimatik biyotinilasyon metodu kullanıldı. Yöntem: Çalışma kapsamında hücre yüzey proteinlerini (HYP) biyotin ile etiketlemek için TurboID enzimi Escherichia coli (E. coli) hücrelerinde üretilip saflaştırıldı ve ardından saf enzim hücrelerin bulunduğu kültür ortamına eklenerek HYP'lerin biyotin ile etiketlenmesi sağlandı. Etiketlenen proteinler streptavidin kaplı manyetik boncuklar yardımıyla zenginleştirildi ve ve triptik kesim sonrası nLC-MS/MS sistemi üzerinden analizleri yapıldı. Elde edilen MS-MS sonuçları Proteom Discoverer 2.5, String ve g-Profiler araçları kullanılarak analiz edildi. Sonuçların doğrulanması için ifade düzeyi değişen 2 protein seçilerek (VDAC1 ve N-Cadherin) Western Blot (WB) analizleri yapıldı. WB analizlerinde gözlemlenen bant yoğunluklarındaki değişimler Quantity One yazılımı ile değerlendirildi. Bulgular: Yapılan çalışmalar sonucunda toplamda 1112 adet protein tanımlanmış ve analiz edilmiştir. Bu proteinlerin 425 tanesi plazma membranı (PM) lokalize olurken, 217'sinin hücre dışı matriks, salgı proteinleri ve hücre-hücre bağlantı proteinlerinden oluştuğu görüldü. Kalan 470 adet protein analiz edildiğinde ise bu proteinlerin ağırılıklı olarak mitokondri, endoplazmik retikulum, golgi ve diğer hücresel membranlarda lokalize olduğu belirlendi. nLC-MS/MS verileri kullanılarak yapılan karşılaştırmalı analizler sonucunda 194 plazma proteinin hücre grupları arasında anlamlı farklılıklar gösterdiği saptandı. VDAC1 ve N-Cadherin antikorları kullanılarak doğrulama amaçlı yapılan analizler, nHPLC LC-MS/MS analizleri ile benzer sonuç verdiği ve tasarlanan yaklaşımın güvenilir bir şekilde çalıştığı görüldü. Sonuç: Tez kapsamında geliştirdiğimiz yeni ve özgün yaklaşımla yapılan HYP'lerin biyotin ile etiketlenmesi ve sonrasında streptavidin boncuklar ile zenginleştirilmesi başarılı bir şekilde gerçekleştirildi. Elde edilen sonuçlar hücreler grupları arasında ifade farklılıklarının olduğunu gösteren 194 adet proteinin varlığını ortaya koydu ve bu proteinlerin potansiyel biyobelirteç adayı olduğunu gösterdi. Aynı zamanda literatürde yapılmış olan çalışmaların sonuçlarımızı büyük çoğunlukta doğrulandığı görüldü. Tez kapsamında belirlediğimiz aday biyobelirteçlerin büyük bir çoğunluğu son 5 yıl içerisinde farklı kanser hastalıkları ile ilişkilendirilmiş olup, bunlar ile alakalı kısıtlı sayıda çalışmanın yapıldığı anlaşılmıştır. Bazı proteinlerin ifade düzeylerindeki değişim ise çalışmamız kapsamında ilk defa meme kanseri hücre hatlarında gösterilmiştir. Bu proteinlerin meme kanseri oluşumunda veya metastazındaki etkileri ve muhtemel ilaç hedefi olup olamayacakları gelecekte yapılacak çalışmalarla irdelenmelidir. Gelecekte elde edilecek veriler meme kanserinin erken tanısına dair ipuçlarını içerisinde barındıracaktır.