Protein kalite kontrolünde görev alan FtsH-HflKC protein kompleksinin yapısal biyolojisi

---

Tezin Türü: Doktora

Tezin Yürütüldüğü Kurum: Kocaeli Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, BİYOLOJİ ANABİLİM DALI, Türkiye

Tezin Onay Tarihi: 2024

Tezin Dili: Türkçe

Öğrenci: GÜNCE GÖÇ

Danışman: Yonca Yüzügüllü Karakuş

Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu

Özet:

Escherichia coli membran proteini FtsH, AAA+ ATPaz ve metalloproteaz özelliklerine sahip, yanlış katlanmış veya hatalı proteinleri parçalayan bir proteindir. FtsH'nin proteolitik aktivitesi, HflKC tarafından düzenlenmektedir. Bu çalışma, FtsH-HflKC kompleksinin biyokimyasal karakterizasyonunu ve yapısal analizini içermektedir. FtsH-HflKC ve HflKC'nin rekombinant üretimi, Lemo21 (DE3) konak hücrelerinde optimize edilmiş, Streptaktin ve/veya Kobalt reçineleri kullanılarak saflaştırılmıştır. FtsH ve FtsH-HflKC'nin proteolitik deneyleri, ATP varlığı ve yokluğunda %0,4 kazein kullanılarak 574 nm'de 37 ve 50ºC'de gerçekleştirilmiştir. Buna göre 37°C'de ATP yokluğunda FtsH'nin bağıl aktivitesi %100, ATP varlığında %90 olarak belirlenmiştir. FtsH, HflKC ile kompleks oluşturduğunda 37°C'deki ATP varlığında ve yokluğunda bağıl proteolitik aktivitesi sırasıyla %39 ve %40 olarak tespit edilmiştir. Sonuçlar, HflKC'nin FtsH'nin proteolitik aktivitesinde düşüşe neden olduğunu göstermiştir. ATPaz aktiviteleri, farklı ATP konsantrasyonlarında 360 nm'de incelenmiştir. 2 µM FtsH ve FtsH-HflKC'nin 10 mM ATP varlığında spesifik aktiviteleri sırasıyla 9,97 U/mg ve 3,85 U/mg olarak hesaplanmıştır. Yapısal analizde, FtsH-HflKC, TEM, Kriyo-EM ve SAXS ile incelenmiştir. RELION 4.1 ve CryoSPARC programlarında FtsH-HflKC'nin üç boyutlu haritaları elde edilmiştir. İki boyutlu sınıflandırmada FtsH-HflKC'nin dinamik yapısını koruduğu gözlemlenmiştir. Bu nedenle, RELION 4.1'de yapı, FtsH ve HflKC olarak iki ayrı harita şeklinde işlenmiş, CryoSPARC'ta kompleks yapı bir tutularak algoritması esneklik üzerine olan Uniform Olmayan İyileştirme işlemi gerçekleştirilmiştir. C6 simetrisinde olduğu SAXS deneyleriyle desteklenen ve ~27 nm büyüklüğündeki kompleksin çözünürlükleri; RELION 4.1'de FtsH için 8,8 Å, HflKC için 9,32 Å; CryoSPARC'ta tüm yapı için 9,25 Å olarak belirlenmiştir. Harita, hekzamerik FtsH yapısının altı HflKC dimeriyle kompleks oluşturduğunu göstermektedir. Bu araştırma, antibiyotik direnciyle mücadelede önemli katkılar sunarak yeni antibiyotiklerin geliştirilmesine yönelik fırsatlar sağlamaktadır.