Tet-on sistemi ile metil-CPG-bağlanma bölgesi 3 (MBD3) ekspresyonu susturulmuş fibroblast hücrelerinin embriyonik kök hücre kaynaklı eksozomlar aracılığı ile pluripotent hücrelere programlanması
Tezin Türü: Yüksek Lisans
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Kocaeli Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2016
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: CEREN ÖZEL
Asıl Danışman (Eş Danışmanlı Tezler İçin): Gökhan Duruksu
Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu
Özet:Amaç: Mbd3 proteini kromatin yeniden modelleyici faktörlerden oluşan multi-alt birimli NuRD kompleksinin önemli bir parçasıdır. NuRD gen ifadesinin baskılanmasını histon deasetilasyon ve kromozom yeniden modelleme aktivitesi üzerinden gerçekleştirir. Somatik hücrelerde ifadesi yüksek olan Mbd3 geninin susturulması ise gen ifadesi baskılanmasını ortadan kaldırarak epigenetik hafızanın silinmesine izin vermekte ve geriye-programlamada önemli bir yaklaşım teşkil etmektedir. Eksozomlar, hücreler arası sinyal iletimine aracılık eden bir role sahiptirler. EKH kaynaklı eksozomların pluripotensi faktörlerini kodlayan/düzenleyen mRNA'ları ve miRNA'ları aktardıkları gösterilmiştir. Bu çalışmada EKH'lerinden elde edilen eksozomların Mbd3 geni susturulmuş fibroblast hücreleri üzerinde geriye programlama etkisinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Yöntem: Eksozomlar, fare-EKH kültürünün ikinci gününde ultrasantrifüj yöntemiyle elde edildi. Besleyici tabakadan salgılanan ve serumda bulunan eksozomların karışmaması için fare-EKH kültürü besleyici tabaka ve serum olmadan gerçekleştirilmesini mümkün kılan Nunclon-Vita-Surface kapları üzerinde kültüre edildi. İnsan fibroblastlarında shRNA-aracılı Mbd3 susturulması Tet-On-sistemin kontrolünde gerçekleştirildi. Fibroblastlar Mbd3-susturulmasını takiben eksozomlarla ko-kültür gerçekleştirildi ve eksozomların PKH26 boyanmasıyla eksozom transferi belirlendi. EKH-eksozomların fibroblast hücreleri üzerindeki etkileri gen ekspresyon analiziyle belirlendi. Bulgular: EKH-eksozomları aktarılan Mbd3 susturulmuş hücrelerin çoğalmasında ve potensi seviyelerinde artış gözlemlenirken, gen ekspresyon profilinin büyük ölçüde değiştiği belirlenmiştir. Mbd3 susturulmuş hücrelerde eksozom aktarılmasıyla ilişkili olarak özellikle pluripotensi ile ilgili transkripsiyon faktörlerinin ekspresyonları Nanog,Oct4 ve Sox2 sırasıyla 2300, 1600 ve 470 kat artış göstermişken, proto-onkogen c-Myc faktörünün azaldığı belirlenmiştir. Sonuç: Her iki yaklaşımın uygulandığı hücreler dahil olmak üzere EKH-benzeri hücrelere tamanen programlanma gerçekleşmese de, Mbd3 susturulmuş hücrelerde eksozom ile ko-kültür sonrası pluripotent faktörler çok ciddi derecede artmıştır. Bu eksozomların somatik hücrelerin geri programlanmasında destekleyici bir faktör olarak kullanılabileceği bu çalışmada gösterilmiştir. Anahtar Kelimeler: Embriyonik kök hücre, eksozom, Mbd3, yeniden programlama, gen susturulması, Tet-On sistem, shRNA