Akademik Veri Yönetim Sistemi
Tezin Türü: Yüksek Lisans
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Kocaeli Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Temel Tıp Bilimleri, Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2025
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: EBRU DURUR
Danışman: Murat Kasap
Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu
Özet:
| Hücre çekirdeği, genetik materyalin büyük bölümünü barındıran ve gen ekspresyonunu düzenleyerek hücresel aktiviteleri kontrol eden önemli bir organeldir. Nükleer DNA, çeşitli proteinlerle organize edilmiş yapılarla hücrenin işlevini destekleyecek şekilde korunur ve düzenlenir. Çekirdek, bu genetik bilgiyi korurken aynı zamanda birçok fizyolojik olayın gerçekleştiği dinamik bir merkezdir. Organellerin proteomik çalışmaları, hücresel sinyal iletim yollarını ve hücresel işlevlerin moleküler temelini anlamak için kritik öneme sahiptir. Ancak organel proteom analizleri, zenginleştirilen protein fraksiyonlarında organelin gerçek bileşeni olmayan moleküllerin yer alması gibi zorluklarla karşılaşır. Ayrıca, farklı hücre tipleri ve dokular arasında organel bileşimindeki değişiklikler, analizlerde dikkate alınması gereken önemli unsurlardır. Organellerde yer alan birçok protein post-translasyonel modifikasyonlara uğradığı için bu modifikasyonların incelenmesi işlevsel analizler açısından önemlidir. Bu çalışmada, çekirdek proteinlerinin biyotinilasyonu ve zenginleştirilmesi amacıyla Split TurboID biyotin ligaz teknolojisi kullanılarak yeni bir model hücre hattı oluşturulmuştur. Split TurboID, inaktif halde bulunan iki domainin (N-terminal ve C- terminal) rapamisin varlığında birleşerek aktif hale gelmesi ile yakınsal biyotin etiketlemesi gerçekleştirir. Bu sistem, FKBP ve FRB proteinlerini içeren füzyon proteinleri ile daha önceden tasarlanmıştır ve hücre içi biyotinilasyon kontrollü bir şekilde sağlanmıştır. Nükleer proteinlerin biyotinilasyonu, tetrasiklin-indüklenebilir bir sistem aracılığıyla kontrol edilerek çekirdek proteinlerinin enzimatik biyotinilasyonu gerçekleştirilmiştir. MDA-MB-231 meme östrojen ve progesteron duyarsız triple negatif hücre hattı olup agresif seyreden meme kanseri hücrelerini temsil eder. Bu hücrelerde kontrollü gen ifadesi yapabilmek için TetR represör proteinini ifade etmelerini sağlama gerekir. Bu amaçla MDA- MB-231 hücrelerine TetR represör proteinini kodlayan pcDNA6/TR plazmiti transfekte edilmiş ve blasticin antibiytoiği ile seçilim yapılarak monklonal bir hücre hattı oluşturulmuştur. Elde edilen TetR+ monoklonal hücre hattına bir sonraki adımda Split TurboID-N terminalini kodlayan pcDNA4/TO plazmiti transfekte edilmiş ve zeosin varlığında seçilim yapılarak monoklonal bir hücre hattı oluşturulmuştur. Çalışmanın son aşamasında ise elde edilen TetR+ ve SplitTurboID-N terminal+ monoklonal hücre hattına Split TurboID-C terminalini kodlayan pcDNA3.1 plazmiti transfekte edilmiş, ve hücreler genetisin ile seçilime tabi tutularak monoklonal bir hücre hattı oluşturulmuştur. Oluşturulan bu hücre hattı Split-TurboID enziminin N-terminal domainini tetrasiklin kontrolünde ifade ederken C-ucunu sürekli ifade etmektedir. Ayrıca, biyotinilasyon aktivitesinin sıkı bir şekilde kontrol edilebilmesi için aktif enzim oluşumu rapamisin indüksiyonuna bağlanmıştır. Kısaca, tez kapsamında geliştirilen hücre hattında tetrasiklin ve rapamisin varlığında varlığında N-terminal ve C-terminal domainleri birleşerek aktif TurboID enzimini oluşturmuş, biyotin ve ATP'nin varlığında çekirdek proteinlerinin biyotinilasyonunu gerçekleştirmiştir. Bu biyotinilasyon işlemi, immün floresan ile doğrulanmış ve çekirdek lokalizasyonu gözlenmiştir. Böylece yeni bir model hücre hattı elde edilmiştir. |