SIÇAN TESTİS DOKUSUNDA KADMİYUMUN TOKSİK VE QUERCETİNİN KORUYUCU ETKİLERİNİN MİTOFAJİ İLE İLİŞKİSİNİN ARAŞTIRILMASI

---

Tezin Türü: Doktora

Tezin Yürütüldüğü Kurum: Kocaeli Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Temel Tıp Bilimleri, Türkiye

Tezin Onay Tarihi: 2023

Tezin Dili: Türkçe

Öğrenci: Kübra KAVRAM SARIHAN

Danışman: Melda Yardımoğlu Yılmaz

Özet:

Tez Başlığı: SIÇAN TESTİS DOKUSUNDA KADMİYUMUN TOKSİK VE QUERCETİNİN KORUYUCU ETKİLERİNİN MİTOFAJİ İLE İLİŞKİSİNİN ARAŞTIRILMASI

KOÜ Bilimsel Araştırma Projeleri Doktora Tez Proje ID: 2506; Proje Kodu: TDK-2021-2506.

Materyal ve Metod: Deneyler, 8 haftalık (200-250 gr) Wistar albino cinsi erkek sıçanlar üzerinde 20-22 °C oda sıcaklığında, 12 saat aydınlık 12 saat karanlık ortamda yapıldı. Kontrol gruplarında 6’şar, deney grupların da 7’şer adet hayvan olacak şekilde gruplar oluşturuldu (Wang vd., 2020a). Kontrol ve deney grupları aşağıdaki şekildedir:

1.         Kontrol grubu(n=24): Her hayvana 1 ml %0,9 salin her gün intraperitoneal (i.p) olarak uygulandı.

2.         Kadmiyum grubu (n=21): Her hayvana 1 mg/kg kadmiyum her gün % 0.9’luk salin içerisinde çözülerek i.p olarak uygulandı (Babaknejad vd., 2018).

3.         Kadmiyum + Quercetin grubu (n=21): Her hayvana  1 mg/kg kadmiyum + 50 mg/kg quercetin her gün %0,9’luk salin içerisinde çözülerek i.p olarak uygulandı (Babaknejad vd., 2018; İnce 2020).

Deney sürelerinin (0. Gün, 1.hafta, 3.hafta ve 5. haftada) sonunda (Wang vd.,2020a), i.p olarak uygulanan Ketamine (90 mg/kg) ve Xylazine (10 mg/kg) anestezi altında, kontrol ve deney gruplarındaki hayvanlardan intrakardiyak infüzyonla kan örnekleri alındı ve dokuların kan bileşenlerinden etkilenmemesi için serum fizyolojik ile intrakardiyak olarak perfüze edildi.

Histolojik Doku Takibi: Deneyler sonrası hayvanlardan çıkarılan testis doku örnekleri, histopatolojik incelemeler için %10 tamponlanmış formaldehit içerisinde 24-48 saat fikse edildi. Daha  sonra doku takip işlemleri yapılarak testis dokuları parafin bloklara gömüldü. Bu bloklardan mikrotom aracılığıyla lamlara 4-5 μm kalınlığında seri kesitler alındı.

Hematoksilen-Eozin Boyaması: Tüm gruplara ait testis dokularından alınan kesitlere, Hematoksilen-Eozin (H-E) boyaması uygulandı. Boyanan kesitler ışık mikroskobunda incelendi ve testiküler-spermatogenik hasarın seviyesini değerlendirmek için Johnsen’in tübüler biyopsi skorlaması yapıldı (Nna vd., 2017)

İmmünfloresan Yöntemi: Eksi 80°C’de saklanan testis örnekleri çözüldükten sonra Tissue-Tek içerisine gömüldü. Ara basamaklardan sonra primer antikorlar gece boyunca +4 ^oC’de inkübasyon sürecinden sonra, yine aarabasamaklardan sonra sekonder antikor ile karanlıkta 2 saat inkübasyon sürecinden sonra DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) ile muamele edildi. Daha sonra kesitler, anti-fade mounting medium kullanılarak lamel ile kapatıldı.  

Negatif kontroller için de primer antikor eklenmeden inkübasyon uygulanarak immunfloresan boyama işlemi gerçekleştirildi.  Testis dokularına ait immünfloresan görüntüleri Olimpus Cellsens Entery programı ile analiz edildi. Böylelikle proteinlerin lokasyonu, sayısı ve mitokondri morfolojisi açısından değerlendirildi ve proteinlere ait görüntüler yoğunluk açısından Image J programı ile analiz edildi.

WesternBlot Analizi: Sıçan deneyleri her bir sıçandan elde alınan doku örneklerinden protein izolasyonları yapılarak konsantrasyon hesaplanması gerçekleştirilecektir. Her bir sıçandan elde alınan doku örneklerinden protein izolasyonları yapılarak konsantrasyon hesaplanması gerçekleştirildi. Primer ve sekonder antikor uygulamasından sonra uygun solüsyonlar kullanılarak HRP enzimine ait kemilüminesans görüntüler film üzerine aktarılarak filmlerden elde edilen bantlar Quantity One (BioRad) programında analiz edildi ve istatistiksel olarak kantitatif sonuçlar elde edildi. 

Ultrastrüktürel Analizi: Transmission Electron Microscope (TEM)-Geçirimli elektron mikroskobu incelemeleri için sıçanlardan alınan testisler Millonig tamponlu %4’lük soğuk gluteraldehit solüsyonu içerisine alındı; +4 °C’de 12-16 saat tespit edildi. Doku takip işlemlerinden sonra Araldit bloklardan, önce Reichert UM2 mikrotomla 0,5 μm kalınlığında yarı ince kesitler alındı ve toluidin mavisi ile boyanarak istenilen bölgenin tespit edildi.Jeol Jem-1011 model elektron mikroskobunda incelen kesitlerin fotoğrafları Olympus Veleta TEM CCD kamera ile çekildi. Ultrastrüktürel incelemeler gruplar arasında kromatin yapısı (kondansasyon, fragmentasyon gibi), mitokondrinin durumu ve yapısı (mitokondrinin şekli, krista yapısı), membran bütünlüğü (hücre zarı ya da nuklear membran) gibi subsellüler detaylar incelenmektedir. 

İş Paketi 6: nLC-MS/MS Analizleri: Gruplara ait protein örnekleri FASP protein kesim (ab270519) kitinin önerdiği protokol takip edilerek tripsin enzimiyle (Pierce, kat. No. 1862748) gerçekleştirilecektir. 

İş Paketi 7: nLC-MS/MS Veri Analizi: LC-MS/MS analizlerinde elde edilecek olan veriler Proteome Discovery programı kullanılarak değerlendirilecektir. 

İstatistik Analizleri: Tüm deney paketlerinden elde edilen veriler değerlendirildikten sonra istatistiksel analiz için hazırlanacaktır. Sonuçların istatistiksel analizleri SPSS 20.0 (SPSS, Chicago, ABD) programı kullanılarak yapılacaktır.