Akademik Veri Yönetim Sistemi
Tezin Türü: Yüksek Lisans
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Kocaeli Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Temel Tıp Bilimleri, Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2023
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: Fatma Zehra Özen
Danışman: Murat Kasap
Özet:
Çekirdek hücrenin merkezinde bulunan, genetik bilgiyi saklayan,
koruyan, kullanan ve bu yolla birçok hücresel olayı yöneten bir organeldir.
Hücre içerisinde uç birleştirme, transkripsiyon, replikasyon ve DNA onarımı
gibi birçok fizyolojik olayın gerçekleştiği oldukça önemli bir organeldir. Hücre
içi organellerde bulunan proteinler, organellerin hücre içi görevlerini ve
ilişkilerini dikte eden öğelerdir. Organel proteom çalışmaları ilgi duyulan
organelin klasik hücre biyolojisi teknikleri kullanılarak izolasyonu ve izole
edilen organelden hazırlanan zenginleştirilmiş protein özütlerinin tanımlanması
prensibine dayanmaktadır.Literatürde çekirdek
proteomu çalışmaları için kullanılan ticari kitler aracılığı ile basit
fraksiyonlama teknikleri ya da densite gradyan santrifügasyonu yaklaşımları
kullanılmaktadır. Ancak bu tür yaklaşımlarda bazı eksiklikler bulunmaktadır. Bu
eksiklikler arasında (1) sitoplazmik protein kontaminasyonları (2) sitoplazmik
proteaz kaynaklı protein degredasyonu gibi sorunlar söylenebilir. Yapılan bu
çalışmada ise belirtilen eksikliklerin giderilmesi ve çekirdek proteomunun
daha net çalışılabilmesi için farklı bir yaklaşım kullanılmıştır.
Bu
yaklaşımda; çekirdek izolasyonuna gerek kalmadan çekirdek proteinlerinin
enzimatik biyotinilasyon aracılığı ile biyotinile edilip zenginleştirilerek
tanımlanması gerçekleştirilmiştir. Enzimatik
biyotinilasyon amaçlı kullanılacak enzim modifiye edilmiş TurbolD enzimi olup,
Split TurboID (Bölünmüş TurbolD) olarak bilinmektedir. Split TurboID, ayrı ayrı
iken inaktif olan 8kDa’lık N-terminal domaini ve 27kDa’lık C-terminal
domaininden oluşmaktadır. Biyotin ligaz enzimine ait bu iki domain bir araya
geldiğinde aktif enzim hale geçerek ortamda biyotin ve ATP varlığında yakınsal
etiketleme ile proteinleri lizin aminoasitlerine bağlanarak biyotinile
etmektedir. Enzime ait iki domainin etkileşimi ve aktif forma geçmesi için
Rapamisin varlığında etkileşim sağlayan FKBP ve FRB proteinleri kullanılarak
füzyon protein tasarımı yapılmıştır. Hücre içerisinde kontrollü biyotinilasyonun
sağlanması için Split TurboID-N terminalini içeren füzyon protein pcDNA4/TO
plazmiti içerisine klonlanmıştır. Bu sayede kültür ortamında tetrasiklin
varlığında Split TurboID-N füzyon protein ekspresyonu kontrollü bir şekilde
gerçekleştirilmiştir. Enzimin C terminalini içeren füzyon protein ise pcDNA3.1
plazmitine klonlanarak, hücre içerisinde sürekli protein ekspresyonunun
gerçekleşmesi sağlanmıştır. Stabil HEK293T TetR+_Split TurboID –N-C
hücrelerinde besi yeri ortamına, N terminalinin ekspresyonu için tetrasiklin,
reaksiyon substratı olarak biyotin ve etkileşimi sağlaması için rapamisin
kompotentlerinin eklenmesi ile eksprese edilen füzyon proteinler çekirdeğe
yönlenerek biyotinilasyon reaksiyonunu gerçekleştirmişlerdir. Bu sayede nükleer
proteinler biyotinile edilmiş ve Streptavidin kaplı boncuklar kullanılarak
zenginleştirilmiştir. Zenginleştirilen proteinler triptik kesim sonrası
LC/MS-MS analizleri ile tanımlanmıştır.
Yapılan çalışmanın sonucunda 361 protein tanımlanmış, bu
proteinlerden 302 adetinin çekirdek proteomu içerisinde bulunduğu yapılan GO
(Gene Ontology) analizi ile tespit edilmiştir. Elde edilen sonuca göre
geliştirilen bu yaklaşımın çekirdek proteom çalışmalarında yaklaşık %83.6
oranında verimlilikle çalıştığı gösterilmiştir.
Tez çalışması kapsamında geliştirilen bu yeni
ve özgün yaklaşımda nükleer proteinlerin tanımlanması için biyotin ile
etiketlenmesi ve streptavidin kaplı boncuklar ile zenginleştirilmesi başarılı
bir şekilde gerçekleştirilmiştir. Elde edilen sonuçlar yapılan bu çalışmada
uygulanılan yaklaşımın çekirdek proteomu çalışmalarında yüksek verimlilikle
kullanılabileceğini göstermiştir.