Akademik Veri Yönetim Sistemi
Tezin Türü: Yüksek Lisans
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Kocaeli Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Temel Tıp Bilimleri, Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2023
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: Elif Akıncı
Danışman: Gürler Akpınar
Özet:
Meme kanseri insidansı ve mortalitesi yüksek olan genellikle kadınlarda görülen ve GLOBOCAN 2020 veri analizlerine göre akciğer kanserinden sonra en çok görülen kanser türüdür. Kanser hücrelerinin normal hücrelere kıyasla bulundukları nişi değiştirdikleri ve enzimler, büyüme faktörleri ve hücreler arası matriks proteinleri gibi farklı molekülleri hücre dışına salgıladıkları bilinmektedir. Bu moleküler immün sistemden kaçış, hipoksik çevrenin oluşturulması, matestaz ve invazyon gibi pek çok farklı süreçte kritik roller üstlenmektedir. Bu nedenle normal hücrelere kıyasla kanser hücrelerinde değişiklik gösteren salgı moleküllerinin belirlenmesi hem süreç içerisindeki mekanizmaların anlaşılması hem de bu mekanizmaların hedeflenmesi ile tanı ve tedavi alanlarında yeni hedeflerin ortaya çıkartılması için oldukça önemlidir. Kanser hücre biyolojisinin anlaşılmasında ve tanıya yönelik biyobelirteçlerinin keşfinde sekretom proteinleri değer taşımaktadır. Ancak hücre kültüründe yapılan sekretom analizinde karşılaşılan bazı zorluklar mevcuttur. Kısaca özetlemek gerekirse; hücre kültürü medyasındaki sekretom proteinlerinin yüksek dilüsyonu, hücre lizizi ve hücre ölümü kaynaklı proteinlerin sekretom proteinleri ile karışması sonucu salgı proteinlerinin maskelenmesi, kültür medyasında bulunan serum proteinlerinin salgı proteinlerini baskılaması dolayısı ile yaşanan güçlükler literatürdeki çalışmalarda yer almaktadır.
Bu tez çalışmasında, salgı proteinlerininin endoplazmik redikulumda (ER) biyotinilasyon aracılığla işaretlenmesi ve daha sonrasında kültür medyasından biyotinile haldeki salgı proteinlerinin streptavidin kaplı manyetik boncuklar kullanarak zenginleştirilmesi amaçlanmıştır. Böylece ölü hücrelerden salınan proteinlerin ve sitozolik proteinlerin, salgı proteinlerini maskelemesinin önüne geçilmesi hedeflenmiştir. Bu kapsamda biyotinilasyon gerçekleştiren TurboID biotin ligaz enzimi kullanılmıştır. Sağlıklı meme epital hücresi MCF-10A, non-invaziv özellikteki MCF-7 ve invaziv özellikteki MDA MB 231 hücrelerine pDisplay_KDEL_ER_TurboID plazmiti transfekte edilmiş ve Geneticin antibiyotiği ile seçilim yapılmıştır. Hücreler uygun yoğunluğa geldiğinde 300mM ATP, 500mM MgCl2, 50mM biotin, %2 FBS içeren medyada 16 saatlik biyotinilasyon reaksiyonu gerçekleştirilmiştir.
Immünfloresan boyamalarla TurboID ifadesi ve ER proteinlerinin biyotinilasyonu gösterilmiştir. Sekretom ortamından biyotinile haldeki proteinler streptavidin kaplı manyetik boncuklar kullanılarak zenginleştirilmiştir. Biyotinilasyonun etkinliği, sekretom örneklerinde Western Blot (WB) analizleri yapılarak doğrulanmıştır. nLC-MS/MS analizleri sonucunda invaziv özellikteki MDA MB 231 hücrelerinde non-invaziv özellikteki MCF-7 hücrelerine kıyasla yukarı regüle olan 5 adet protein tanımlanmıştır. Bu proteinler arasından Kardiyak Troponin I protein ekspresyonu hücre özütleri, sekretom örnekleri ve doku örneklerinde WB analizleri yapılarak incelenmiştir. nLC-MS/MS ve WB analizleri sonucunda, troponin sekrasyonunun invaziv özellikteki MDA MB 231 hücrelerinde daha fazla olduğu saptanmıştır. Elde ettiğimiz bu sonuç literatürde yer alan troponin ve kanser ilişkisini destekler ve tamamlayıcı nitelikte bilgiler edinilmiştir. Bu tez çalışmasında tanımlanmış olan metaztaz ile ilişkilendirilebilecek proteinler sayesinde literatüre güncel bilgiler kazandırılmış ve meme kanseri tanı ve tedavisine yönelik çalışmalara öncülük edebilecek veriler elde edilmiştir.