Akademik Veri Yönetim Sistemi
Tezin Türü: Yüksek Lisans
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Kocaeli Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Temel Tıp Bilimleri, Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2024
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: ELİFCAN KOÇYİĞİT
Danışman: Murat Kasap
Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu
Özet:
Amaç: Bakteriyel Membran proteinleri hücrelerin içine ve dışına madde taşınımını, hücrelerin diğer hücrelerle veya çevresindeki moleküllerle etkileşime girmesini, hücre duvarının ve zarının yapısını ve bütünlüğünün korunmasını, hücre içi ve hücre dışı sinyal moleküllerinin algılanmasını ve hücrelerin çevresel faktörlere karşı cevap oluşturmasını sağlarlar. Membran proteinlerini tanımlama çalışmaları bu proteinlerin üstlendiği görevleri ve yer aldıkları mekanizmaları aydınlatmak açısından oldukça önemlidir. Biyotinilasyon son dönemde kullanım alanı giderek artan ve proteinleri tanımlamak için de kullanılan bir yöntemdir. Bu çalışmada, enzimatik ve kimyasal biyotinilasyon yöntemlerinin bakteri membran proteinlerini işaretleyerek yüksek sayıda protein tanımlamak için kullanılabileceğini göstermeyi, aynı zamanda da iki yöntemi birbiriyle karşılaştırmayı amaçladık. Yöntem: Bakterilerin membran proteinlerini biyotinlemek için enzimatik (TurboID-enzim tabanlı) ve kimyasal (Sulfo-NHS-LC-Biotin tabanlı) biyotinilasyon yöntemleri kullanılmıştır. Öncelikle rekombinant yolla TurboID enzimi histidin etiketli olarak üretilmiş ve aktif halde saflaştırılmıştır. Saflaştırılan enzimle ve kimyasal biyotin reaktifi kullanılarak E. coli K12 hücrelerinin membran proteinleri biyotin ile işaretlenmiştir. Bakteriler lizize uğratılarak protein özütleri hazırlanmış ve streptavidin kaplı manyetik boncuklar aracılığıyla biyotinile proteinler zenginleştirilmiştir. Biyotinilasyon ve zenginleştirme aşamaları Western Blot analizleriyle doğrulanmıştır. Zenginleştirilen biyotinile proteinler ve biyotinile edilmeyen bakteri protein özütleri triptik kesime tabi tutulmuş, elde edilen peptitlerle nLC-MS/MS analizleri gerçekleştirilmiştir. Bulgular: Yapılan nLC-MS/MS analizlerine göre biyotinile edilen gruplarda biyotinile edilmeyen gruba göre daha fazla sayıda membran proteini tanımlanmıştır. Biyotinile olmayan grupta 419 adet membran proteini tanımlanırken, enzimatik yolla biyotinile edilen grupta 463, kimyasal yolla biyotinile edilen grupta 582 adet protein tanımlanmıştır. Sonuç: Enzimatik ve kimyasal biyotinilasyon yöntemlerinin karşılaştırmalı analizleri her iki yönteminde etkin bir biçimde membran proteinlerini tanımlama kullanılabileceğini göstermektedir. Her ne kadar biyolojik biyotinilasyon yöntemi fiyat avantajı sunsa da, kimyasal biyotinilasyon yöntemi ile daha fazla membran proteininin tanımlanmış olması bu yöntemin biyolojik biyotinilasyona göre tercih edilmesi gerektiğini göstermektedir. Ayrıca, yapılan tekrarlı deneylerde her iki yönteminde tekrar edilebilir olduğu gösterilmiştir. Bu bulgu, her iki yöntemle de karşılaştırmalı proteom çalışmalarının yapılabileceğine işaret etmektedir. Çalışmamız kapsamında optimize edilmiş olan protokoller kullanılarak gerçekleştirilecek çalışmalar ile antibiyotik dirençli bakteri suşları ile dirençsiz bakteri suşları arasında membran protein farklılıklarını ortaya çıkarmak ve mekanistik bilgi üretmek mümkün olacaktır.