DETERMINATION OF CYTOKINE PROFILES OF M1 AND M2 POLARIZED MACROPHAGES, DIFFERENTIATED FROM U937 MONOCYTIC CELLS BY CHEMICAL INDUCTION


Hunç F. , Duruksu G. , Dillioğlugil M. Ö.

VII. Türkiye in vitro Diyagnostik (IVD) Sempozyumu, İzmir, Turkey, 27 - 29 April 2022

  • Publication Type: Conference Paper / Unpublished
  • City: İzmir
  • Country: Turkey

Abstract

DETERMINATION OF CYTOKINE PROFILES OF M1 AND M2 POLARIZED MACROPHAGES, DIFFERENTIATED FROM U937 MONOCYTIC CELLS BY CHEMICAL INDUCTION

Fatih Hunc1*, Gökhan Duruksu2, Meltem Ozlen Dillioglugil1

1Department of Biochemistry, School of Medicine, Kocaeli University, Kocaeli, Turkey

2 Center for Stem Cell and Gene Therapies Research and Practice, Kocaeli University, Kocaeli, Turkey

Objectives: U937 cells, human hematopoietic cell line with pro-monocytic properties were derived from the pleural effusion of a 37-year-old male patient with histiocytic lymphoma. U937 cells can be differentiated into different forms of macrophages with various activation and polarization protocols based on chemical induction. This cell line is used in many in vitro studies with the aim to investigate the different polarized macrophages and their effects. In this study, it was aimed to differentiate U937 cells into M1 and M2 polarized macrophages by chemical induction and subsequent quantitative analysis of secreted pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines in order to perform metabolic characterization of differentiated cells.

Materials-Methods: Early passage U937 monocytic cells (ATCC® CRL-1593.2) are firstly differentiated into nonpolarized M0 mature macrophages with the treatment of phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA). M0 macrophages were treated with lipopolysaccharide (LPS) and interferon-gamma (IFN-γ) to obtain M1 polarization. Whereas, M2 polarization was carried out with the interleukin 4 (IL-4) treatment of the M0 macrophages. Cell culture mediums for both groups were collected after 24 hours of induction. Analysis of cytokines IL-1β, IL-6, TNF-α, TGF-β, IL-10, and IL-12p70 in the medium was performed by ELISA method, kit (E0143Hu, E0090Hu, E0082Hu, E3051Hu, E0099Hu, E0102Hu; BT-LAB, China). Statistical analysis of data was conducted using with Graphpad Prism 9.0 software. Independent samples t-test was used to compare the means between groups.

Results: As pro-inflammatory cytokines, IL-1β and IL-12p70 levels were found to be statistically significantly higher in M1 polarized macrophage group compared to the M2 polarized macrophage group, while IL-6 levels were higher in M2 group. Moreover, IL-10 levels and IL/10/IL-12p70 ratio as anti-inflammatory profile, were higher in M2 group compared to the M1 group. While TGF-β levels were higher in M2 group, a statistically significant difference was not revealed between groups to some extent apart from the assumption.

Conclusions: In particular, our findings support IL10/IL12p70 ratio might serve as a reliable indicator to distinguish polarization state of the macrophages.Macrophages have differentiation plasticity in response to environmental stimuli, transform into M1 and M2 polarized macrophages and exhibite distinct effector functions.

Keywords: U937, cellular differentiation, M1 polarized macrophages, M2 polarized macrophages, inflammation

U937 MONOSİT HÜCRELERİNDEN KİMYASAL UYARIMLA FARKLILAŞTIRILAN M1 VE M2 POLARİZE MAKROFAJ HÜCRELERİNİN SİTOKİN PROFİLLERİNİN BELİRLENMESİ

Fatih Hunç1*, Gökhan Duruksu 2, Meltem Özlen Dillioğlugil1

1Kocaeli Ünviersitesi, Tıp Fakültesi, Biyokimya Anabilim Dalı, Kocaeli, Türkiye

2 Kök Hücre ve Gen Tedavileri Araştırma ve Uygulama Merkezi, Kocaeli Üniversitesi, Kocaeli, Türkiye

Amaç: U937 hücreleri 37 yaşındaki histiyositik lenfomalı bir erkek hastanın plevral efüzyonundan elde edilmiş, pro-monositik özellikler sergileyen insan hematopoietik hücre hattıdır[1-3]. U937 hücreleri farklı kimyasal uyarım protokolleri ile farklı polarize aktif makrofaj hücrelerine farklılaştırılabilmektedir[4]. Farklı polarize makrofajların etkilerinin araştırıldığı in vitro desendeki birçok araştırmada kullanılan temel hücre hattıdır. Bu çalışmada, U937 hücrelerinin kimyasal uyarımla M1 ve M2 farklı polarize makrofajlara farklılaştırılması ve sonrasında bu aktif makrofajlar tarafından sekrete edilen pro-enflamatuar ve anti-enflamatuar sitokinlerin kantitatif analizleri ile metabolik karakterizasyonlarının gerçekleştirilmesi amaçlanmıştır. 

Gereç-Yöntem: Öncelikle, erken pasaj U937 monosit hücreleri (ATCC® CRL-1593.2) phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA) ile nonpolarize M0 matür makrofaj hücrelerine farklılaştırılır. M0 makrofajlar, lipopolisakkarit ve interferon-gama ile uyarılarak M1 polarize makrofajlara; interlökin-4 ile uyarılarak M2 polarize makrofaj diferansiyasyonu gerçekleştirilir. 24 saatlik indüksiyon sonunda hücre kültür medyum içeriğindeki IL-1β, IL-6, TNF-α, TGF-β, IL-10 ve IL-12p70 sitokinleri ELİSA yöntemiyle, kit (E0143Hu, E0090Hu, E0082Hu, E3051Hu, E0099Hu, E0102Hu; BT-LAB, Çin) talimatlarına uygun şekilde analiz edilmiştir. Verilerin istatistiksel analizinde, GraphPad Prism 9.0 yazılımı kullanılmıştır. Bağımsız örneklem t testi ve pearson korelasyon analizi uygulanmıştır.

Bulgular: M1 polarize makrofaj grubunda pro-enflamatuar sitokinlerden IL-1β ve IL-12p70 düzeyleri M2 grubuna göre istatistiksel anlamlı şekilde daha yüksek iken, IL-6, M2 grubunda yüksektir. M2 grubunda IL-10 düzeyleri ile IL/10/IL-12p70 oranı M1 grubuna göre anlamlı şekilde daha yüksektir. TGF-β düzeyleri, gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark olmadan M2 grubunda daha yüksektir.

Sonuç: Makrofajlar plastisite özelliğine sahip bağışıklık hücreleri olarak farklı çevresel uyarılar neticesinde pro-enflamatuar veya anti-enflamatuar karakterlere sahip M1 ve M2 polarize makrofajlara farklılaşabilmektedirler. Bu farklılaşmada, IL10/IL12p70 oranı güvenilir bir belirteç olarak düşünülebilir.

Anahtar kelimeler: U937, hücre farklılaşması, M1 polarize makrofaj, M2 polarize makrofaj, enflamasyon