SERUM miRNA İZOLASYONUNDA VERİMİ ARTIRMAYA YÖNELİK PROTOKOL MODİFİKASYONLARININ DEĞERLENDİRİLMESİ

Creative Commons License

Halis F. Ö., DUMAN E., Ozmen O.

Acta Medica Nicomedia, cilt.9, sa.0, ss.1-5, 2026 (TRDizin)

Özet

Amaç: Bu çalışmada, serum örneklerinden elde edilen mikroRNA'nın (miRNA) verim ve saflığını artırmak amacıyla ticari bir miRNA izolasyon kitinde uygulanan çeşitli protokol modifikasyonlarının etkilerinin değerlendirilmesi amaçlanmıştır. Yöntem: Standart kit protokolü ile elde edilen düşük ribonükleik asit (RNA) verimi ve saflığı sonrasında; Proteinaz K eklenmesi (D1), liziz tamponunun 55°C'de ön ısıtılması (D2), enhancer solüsyonunun faz ayrımı sonrası süpernatanta eklenmesi (D3), başlangıç serum hacminin iki katına çıkarılması (D4) ve elüsyon işleminin aynı elüat ile tekrarlanması (D5) modifikasyonları tekil ve kombine şekilde uygulanmıştır. İzolasyon başarısı NanoDrop spektrofotometresi ile ölçülen RNA konsantrasyonu ve A260/A280 oranları üzerinden değerlendirilmiştir. Bulgular: Elüsyon işleminin aynı elüat ile tekrarlanması (D5) ve liziz tamponunun ön ısıtılması (D2), örnek kalitesini koruyarak RNA veriminde belirgin artış sağlamıştır (P5: A260/A280=2,07; 26,7 ng/μL). Proteinaz K ilavesi (D1) ve enhancer modifikasyonu (D3), RNA konsantrasyonunda önemli artışlar oluşturmuş olmakla birlikte A260/A280 oranlarının ideal aralığın üzerine çıkmasına neden olmuştur. Serum hacminin artırılması (D4) ise kolon kapasitesine bağlı sınırlılıklar nedeniyle belirgin bir avantaj sağlamamıştır. Sonuç: Bu ön optimizasyon çalışmasında, elüsyon aşamasının tekrarlanması ve liziz tamponunun ön ısıtılması, serumdan miRNA izolasyonunda verim artışı sağlayan ve örnek kalitesini koruyan modifikasyonlar olarak öne çıkmıştır. Proteinaz K ve enhancer uygulamalarının ise ileri optimizasyon çalışmaları ile yüksek verim elde edilmesinde potansiyel taşıdığı düşünülmektedir.
Objective: This study aimed to evaluate the effects of various protocol modifications applied to a commercial microRNA (miRNA) isolation kit in order to improve the yield and purity of miRNA obtained from serum samples. Methods: Following the low ribonucleic acid (RNA) yield and purity obtained with the standard kit protocol, several modifications were evaluated individually and in combination, including the addition of Proteinase K (D1), preheating the lysis buffer to 55°C (D2), adding the enhancer solution to the supernatant after phase separation (D3), doubling the initial serum volume (D4), and repeating the elution step using the same eluate (D5). Isolation performance was assessed based on RNA concentration and A260/A280 ratios measured by NanoDrop spectrophotometry. Results: Repeating the elution step (D5) and preheating the lysis buffer (D2) improved RNA yield while maintaining acceptable sample quality (P5: A260/A280=2.07; 26.7 ng/µL). The addition of Proteinase K (D1) and the enhancer modification (D3) resulted in substantial increases in RNA concentration; however, both modifications increased A260/A280 ratios beyond the optimal range. Increasing the serum volume (D4) did not provide a clear advantage, likely due to limitations in column binding capacity. Conclusion: In this preliminary optimization study, repeating the elution step and preheating the lysis buffer emerged as the most promising modifications for improving miRNA yield while preserving sample quality. Proteinase K and enhancer-based modifications may represent useful alternatives for achieving higher yields following further optimization studies.