Akademik Veri Yönetim Sistemi
XIX. Tıbbi Biyoloji ve Genetik Konsgresi, Muğla, Türkiye, 27 - 30 Ekim 2025, ss.97, (Özet Bildiri)
Amaç: Bu çalışmada, mitokondri ve çekirdek arasındaki çapraz konuşmayı
incelemek üzere yeni bir hücresel model geliştirilmesi amaçlanmıştır. Bu
modelde, çekirdekte kontrollü Split-TurboID ekspresyonu bulunan HEK293T
hücrelerinde, bakteriyel toksin proteini Hok’un iç mitokondriyal membrana
hedeflenen formu indüklenmiştir. Böylelikle Hok aracılığıyla tetiklenen
mitokondriyal ağ bozulmasının, çekirdek-mitokondri etkileşimi ve
çekirdekteki mitokondriyal proteinlerin düzenlenmesi üzerindeki etkileri
değerlendirilmiştir.
Gereç-Yöntem: Kodon optimizasyonu yapılmış, GFP ile işaretli Hok geni
sentezlenerek pCDNA4/TO vektörüne klonlandı. Bu yapı, kontrollü
biyotinilasyon kapasitesine sahip Split-TurboID enzimini ifade eden
HEK293T-TetR+-Split-TurboID-N-C hücrelerine transfekte edilerek
monoklonal, stabil bir hücre hattı oluşturuldu. Split-TurboID, taşıdığı nükleer
lokalizasyon sinyali aracılığıyla çekirdekte; Hok-GFP ise mitokondri iç zar
lokalizasyon sinyali sayesinde mitokondride lokalize oldu. Split-TurboID’nin
hücre içi lokalizasyonu V5 ve HA antikorları ile doğrulandı; nükleer
proteinlerin biyotinilasyonu Texas Red-konjuge neutravidin antikoru
kullanılarak immünofloresan mikroskopi ile gösterildi. Hok-GFP ifadesi
sonrası mitokondriyal lokalizasyon ve buna bağlı ağ bozulması
immünofloresan mikroskopiyle izlendi. Hok ifadesinin ardından
biyotinlenmiş nükleer proteinler saflaştırıldı ve nHPLC-LC-MS/MS ile
tanımlandı.
Sonuçlar: Bu çalışma, HEK293T hücrelerinde Hok ekspresyonu aracılığıyla
mitokondriyal ağın bozulmasının, çekirdek proteomuna etkilerini ortaya
koymaktadır. Kontrollerle kıyaslandığında, Hok ifadesinin özellikle 8. saatte
artmasıyla birlikte mitokondriyal ağ bütünlüğü belirgin şekilde bozulmuş,
buna paralel olarak çekirdekte mitokondriyal translasyon ve gen
ekspresyonuyla ilişkili proteinlerde azalma gözlenmiştir. Bu bulgular,
mitokondri-çekirdek iletişiminin moleküler düzeyde anlaşılmasına katkı
sağlayarak, yeni düzenleyici mekanizmaların aydınlatılmasına zemin
hazırlamaktadır.
Tartışma: Hok-RFP ekspresyonunun indüklenmesi mitokondriyal
depolarizasyona ve ağ bütünlüğünün bozulmasına yol açtı. İmmünofloresan
analizler bu sürecin hücre düzeyinde izlenmesini sağladı. Split-TurboID
temelli karşılaştırmalı nükleer proteom analizi, mitokondri-nükleus çapraz
konuşmasında görev alan özgün proteinlerin kimliklerini ortaya koydu.
Anahtar Kelimeler: Çekirdek, Mitokondri, In vitro model, Proteomiks