Amaç: Çekirdek, hücrelerin merkezinde yer alır ve birçok hücresel metabolizmayı yönetir. Ancak proteomik çalışmalarda, proteomunun zayıf zenginleşmesi nedeniyle çekirdeklerle ilgili birçok işlemi derinlemesine anlamamız mümkün olmamaktadır. Bu çalışmada bu önemli organeli detaylı olarak anlamak için nöroblastoma hücre (SH-SY5Y) model kullanarak dört farklı nükleer protein zenginleştirme yönteminin kapsamlı değerlendirmesi yapılmıştır. Yöntem: Nükleer proteinler (NP'ler), ticari kitler veya yoğunluk gradyanlı santrifüjleme metodu kullanılarak izole edilmiştir. İzole edilmiş nükleer proteinlerin saflığı, histonH3, LaminA/C, GAPDH ve Siklofilin A'ya karşı antikorlarla Western Blot (WB) analizi kullanılarak doğrulanmıştır. 2-DE (2 boyutlu jel elektroforez) jelleri ve proteinler MALDI-TOF/TOF analizi ile tanımlanmıştır. Bulgular: Bu karşılaştırmalı çalışmanın sonuçları, Q-Proteome nükleer protein izolasyon kiti'nin (Qiagen, ABD) diğer en yaygın kullanılan farklı ve yoğunluk gradyanı santrifüjasyonu nükleer protein zenginleştirme yöntemleri ile karşılaştırıldığında üstün olduğunu göstermiştir. Bu yöntemle toplanan fraksiyonlar, yalnızca histon H3 ve Lamin A/C antikorları ile bantlar vermiştir. Yaklaşık olarak 2-DE jellerindeki proteinlerin %70'i yerel nükleer proteinler veya nükleer ile ilişkilendirilmiş olarak tahmin edilmiştir. Sonuç: Genel olarak, saflaştırılmış nükleer protein fraksiyonları elde etmek mümkün olmasa da, kültürde yetiştirilen hücrelerden yüksek derecede zenginleştirilmiş nükleer fraksiyonlar elde etmek mümkündür. Çalışmamız, Proteomik'te nükleer protein izolasyonu için önemli bir platform olarak hizmet edecektir.
Objective: Nuclei sits at the center of cells and orchestrates many cellular metabolisim. However, in proteomic studies, we lack of profound understanding of many processes regarding to nuclei due to the poor enrichment of its proteome. In this study, in order to put forward one step in this area of research, comprehensive evaluation of four different nuclear protein enrichment methods were conducted by using neuroblastoma cell lines (SH-SY5Y) as a model. Methods: Nuclear proteins (NPs) have been isolated using either commercially available kits or density gradient centrifugation. The purity of the isolated nuclear proteins have been verified using Western Blot (WB) analysis with antibodies against histonH3, LaminA/C, GAPDH and Cyclophilin A. Further analysis have been performed by using 2-DE (2 dimentioanl gel electrophoresis) gels and the proteins have been identified by MALDI-TOF/TOF analysis. Results: Results from this comparison study demonstrated that Q-Proteome nuclear protein isolation kit (Qiagen, USA) was superior when compared to other most commonly used differential and density gradient centrifugation nuclear protein enrichment methods. Collected fractions using this method gave bands only with anti-histone H3 and anti- LaminA/C antibodies . Approximately 70% of the proteins on 2-DE gels were resident nuclear proteins or predicted to be nuclear-associated. Conclusion: Overall, we demonstrated that although it is not possible to obtain purified nuclear protein fractions, it is feasible to obtain highly enriched nuclear fractions from cells grown in culture. Our study will serve as an important platform for nuclear protein isolation in Protemics.
