Akademik Veri Yönetim Sistemi
11. ULUSAL MOLEKÜLER BİYOLOJİ VE BİYOTEKNOLOJİ KONGRES, İstanbul, Türkiye, 7 - 09 Ekim 2022, ss.38, (Özet Bildiri)
Organel proteom çalışmaları ilgi duyulan organelin klasik hücre biyolojisi teknikleri kullanılarak izolasyonu ve izole edilen organelden hazırlanan zenginleştirilmiş protein özütlerinin tanımlanması prensibine dayanmaktadır. Ancak bu yaklaşım tarzında ciddi eksiklikler bulunmaktadır. Bu eksiklikler arasında (1) zenginleştirme oranının izolasyondan izolasyona farklılık göstermesi (2) çalışılan organele ait olmayan bona fide proteinlerin tanımlanması ve (3) çoğu zaman çalışılacak organelle geçici etkileşim halinde bulunan proteinlerin o organelin bir parçasıymış gibi algılanması sayılabilir. Malesef klasik hücre biyolojisi metotları kullanarak bu sorunları çözmek şu ana kadar mümkün olmamıştır. Bu çalışmamızda alternatif moleküler bir yaklaşım kullanarak çekirdeğe ait proteomu daha özgün ve güvenilir bir şekilde tanımlayabilmeyi hedefliyoruz. Yaptığımız çalışmamızda; çekirdek izolasyonuna gerek kalmadan çekirdek proteinlerinin enzimatik biyotinilasyonu aracılığı ile zenginleştirilmesi mümkün olacaktır. Enzimatik biyotinilasyon amaçlı kullandığımız enzim modifiye edilmiş TurbolD enzimi olup, bölünmüş TurbolD olarak bilinmektedir. Bölünmüş-TurboID, ayrı ayrı iken inaktif olan 8 kDa’lık N-terminal domaini ve 27 kDa’lık Cterminal domaininden oluşmaktadır. Bir biyotin ligaz enzimi olan TurboID’ye ait bu iki domain bir araya geldiğinde enzim aktif hale geçerek ortamda biyotin ve ATP varlığında yakınsal etiketleme ile proteinleri lizin aminoasitlerine bağlanarak biyotinile etmektedir. Enzime ait iki domainin etkileşimi ve aktif forma geçmesi için rapamisin varlığında etkileşim sağlayan FKRB ve FRB proteinleri kullanılarak füzyon protein tasarımı yapılmıştır. Ortamda biotin, ATP ve Rapamisin varlığında bölünmüş TurboID enziminin hücre içerisinde biotinilasyonu gerçekleştirebilmesi için dizi tasarımı ve rekombinant plazmit oluşturmak amacıyla alt-klonlama deneyleri başarıyla tamamlanmıştır. Her iki domaini de eksprese eden stabil hücre hattı oluşturuldu. Spesifik nüklear proteomu biyotinilasyonun sağlanması için N Terminal domaini ekspresyonu tetrasiklin ile kontrollü olarak yapılmaktadır.